Обо всех рнк на свете, больших и малых. Экспрессия генов и малые рнк в онкологии Малые РНК в Онкологии

), предотвращая трансляцию мРНК на рибосомах в кодируемый ею белок. В конечном итоге результат действия малых интерферирующих РНК идентичен тому, как если бы просто снижалась экспрессия гена .

Малые интерферирующие РНК были открыты в 1999 году группой Дэвида Болкомба (англ. David Baulcombe ) в Великобритании как компонент системы пост-транскрипционного сайленсинга генов у растений (англ. PTGS, en:post-transcriptional gene silencing ). Группа опубликовала полученные данные в журнале Science .

Двухцепочечные РНК могут усиливать экспрессию генов по механизму, называемому РНК-зависимой активацией генов (англ. RNAa, small RNA-induced gene activation ). Показано, что двухцепочечные РНК, комплементарные промоторам генов-мишеней, вызывают активацию соответствующих генов. РНК-зависимая активация при введении синтетических двухцепочечных РНК была показана для клеток человека. Не известно, имеется ли подобная система в клетках других организмов.

Давая возможность выключить по существу любой ген по желанию, РНК-интерференция на основе малых интерферирующих РНК вызвала огромный интерес в фундаментальной и прикладной биологии. Число широкоохватных тестов на базе РНК-интерференции для выявления важных генов в биохимических путях постоянно растет. Поскольку развитие болезней также обусловлено активностью генов, ожидается, что в некоторых случаях выключение гена при помощи малой интерферирующей РНК может давать терапевтический эффект.

Однако применение РНК-интерференции на основе малых интерферирующих РНК к животным, и в особенности к людям, сталкивается со множеством трудностей. В экспериментах было показано, что эффективность малых интерферирующих РНК оказывается различной для разных типов клеток: одни клетки легко откликаются на воздействие малых интерферирующих РНК и демонстрируют снижение экспрессии генов, в других же подобного не наблюдается, несмотря на эффективную трансфекцию . Причины этого явления пока что плохо изучены.

Результаты первой фазы испытаний двух первых терапевтических препаратов, действующих по механизму РНК-интерференции (предназначены для лечения макулодистрофии), опубликованные в конце 2005 года, показывают, что препараты на основе малых интерферирующих РНК легко переносятся пациентами и имеют приемлемые фармакокинетические свойства .

Предварительные клинические испытания малых интерферирующих РНК, нацеленных на вирус Эбола , указывают на то, что они могут быть эффективны для постконтактной профилактики заболевания. Данный препарат позволил выжить всей группе подопытных приматов, получивших летальную дозу Заирского Эболавируса

Статья на конкурс «био/мол/текст»: В последние годы РНК - а особенно ее «неклассические» разновидности - приковывает внимание биологов всего мира. Выяснилось, что регуляция с помощью некодирующих РНК широко распространена - начиная от вирусов и бактерий и заканчивая человеком. Изучение разнообразия малых бактериальных РНК-регуляторов ясно показало их важную роль как в промежуточном метаболизме, так и в адаптивных реакциях. В этой статье описаны разновидности малых РНК бактерий и механизмы регуляции, осуществляемые с их помощью. Особый акцент сделан на роли этих молекул в жизнедеятельности бактериальных агентов, вызывающих особо опасные инфекции .

РНК: больше, чем просто копия ДНК

Со школьной скамьи большинству читателей этого сайта известны основные механизмы работы живой клетки. В курсе биологии, начиная с законов Менделя и заканчивая ультрасовременными проектами по секвенированию геномов, красной нитью проходит идея магистральной генетической программы развития организма, известная профессиональным биологам как центральная догма молекулярной биологии . Она гласит, что молекула ДНК выступает носителем и хранителем генетической информации, которая через посредника - матричную РНК (мРНК), и при участии рибосомальной (рРНК) и транспортной РНК (тРНК), - реализуется в виде белков. Последние определяют видовой и индивидуальный фенотип .

Такое положение дел и отведение РНК роли второстепенного участника молекулярного спектакля сохранялось в научной среде вплоть до 80-х годов прошлого века. Пристальнее присмотреться к РНК заставили работы Т. Чека , показавшего, что РНК может выступать в роли катализатора химических реакций. Прежде считалось, что ускорение химических процессов в клетке - прерогатива ферментов , имеющих исключительно белковую природу. Открытие каталитической активности у РНК имело далеко идущие следствия - вкупе с более ранними теоретическими работами К. Вёзе и , оно позволило нарисовать возможную картину пребиотической эволюции на нашей планете. Дело в том, что с момента открытия у ДНК функции носителя генетической информации дилемма о том, что появилось в ходе эволюции раньше - ДНК или белок, необходимый для воспроизводства ДНК, - казалась почти столь же философской (то есть, беспредметной), как и вопрос о первенстве появления курицы или яйца. После открытия Т. Чека решение обрело вполне реальные очертания - была найдена молекула, обладающая свойствами как носителя информации, так и биокатализатора (пусть и в зачаточном виде). Со временем эти исследования переросли в целое направление в биологии, изучающее возникновение жизни через призму так называемого «мира РНК » .

Так стало очевидно, что древний мир РНК мог иметь отношение к зарождению и расцвету первичной жизни. Тем не менее, из этого вовсе не следует автоматически, что РНК у современных организмов - не архаизм, адаптированный под нужды внутриклеточных молекулярных систем, а действительно важный участник молекулярного ансамбля клетки. Лишь развитие молекулярных методов - в частности, секвенирования нуклеиновых кислот , - показало, что РНК истинно незаменимы в клетке, причем не только в виде канонической троицы «мРНК, рРНК, тРНК». Уже первые обширные данные по секвенированию ДНК указали на показавшийся поначалу труднообъяснимым факт - большая часть ее оказалась некодирующей - то есть, не несущей информацию о молекулах белка или «стандартных» РНК. Конечно, частично это можно приписать «генетическому мусору» - «выключенным» или утративших свою функцию фрагментам генома. Но сохранять такое количество «приданого» для биологических систем, старающихся тратить энергию экономно, кажется нелогичным.

И действительно, более детальные и тонкие методы исследования позволили обнаружить целый класс РНК-регуляторов экспрессии генов, частично заполняющих межгенное пространство. Еще до прочтения полных последовательностей геномов эукариот у круглого червя С. elegans были выделены микроРНК - молекулы небольшой длины (около 20 нуклеотидов), которые могут специфично связываться с участками мРНК по принципу комплементарности . Несложно догадаться, что в таких случаях с мРНК уже не прочесть информацию о кодируемых белках: рибосома просто не может «пробежаться» по такому, внезапно ставшему двухцепочечным, участку. Этот механизм подавления экспрессии гена, называемый РНК-интерференцией , уже был разобран на «биомолекуле» достаточно подробно . На сегодняшний день открыты тысячи молекул микроРНК и других некодирующих РНК (piRNA , snoRNA , nanoRNA и др.). У эукариот (в том числе, и у человека) они расположены в межгенных участках. Установлена важная их роль в клеточной дифференцировке, канцерогенезе, иммунном ответе и других процессах и патологиях .

Малые РНК - «троянский конь» для бактериальных белков

Несмотря на то, что некодирующие белок РНК у бактерий были открыты гораздо раньше первых аналогичных регуляторов у эукариот, их роль в метаболизме бактериальной клетки долгое время была завуалирована для научной общественности. Это объяснимо - традиционно бактериальная клетка считалась более примитивной и менее таинственной для исследователя структурой, сложность которой не идет ни в какое сравнение с нагромождением структур в клетке эукариотической. Более того, в геномах бактерий содержание некодирующей информации составляет лишь несколько процентов от общей длины ДНК, достигая максимум 40% у некоторых микобактерий. Но, учитывая, что микроРНК обнаружены даже у вирусов, у бактерий они должны играть важную регуляторную роль и подавно.

Оказалось, у прокариот существует довольно много малых РНК-регуляторов . Условно все они могут быть разделены на две группы:

1. Молекулы РНК, которые для осуществления свой функции должны связаться с белками.
2. РНК, комплементарно связывающиеся с другими РНК (составляют большинство известных регуляторных молекул РНК).

В первой группе выделяют малые РНК, для которых связывание с белком возможно, но необязательно. Известный пример - РНКаза Р (RNAse P), действующая как рибозим на «созревающую» тРНК. Однако если РНКаза Р может функционировать без белкового компонента, то для других малых РНК в этой группе связывание с белком обязательно (а сами они являются, по сути, кофакторами). Например, tmРНК активирует сложный белковый комплекс, выступая в роли «отмычки» для «застрявшей» рибосомы - в случае, если матричная РНК, с которой ведется считывание, подошла к концу, а стоп-кодон так и не повстречался.

Известен и еще более интригующий механизм непосредственного взаимодействия малых РНК с белками. В любой клетке широко распространены белки, связывающиеся с «традиционными» нуклеиновыми кислотами. Не является исключением и прокариотическая клетка. Например, ее гистоноподобные белки помогают корректно упаковать нить ДНК, а специфичные белки-репрессоры имеют сродство к операторной области бактериальных генов. Показано, что эти репрессоры могут ингибироваться малыми РНК, имитирующими «родные» для этих белков участки посадки на ДНК. Так, на малой РНК CsrB (рис. 1) есть 18 сайтов-«обманок» служащих тому, чтобы белок-репрессор CsrA не смог добраться до своей истинной мишени - гликогенового оперона. Между прочим, среди белков-репрессоров, «заблудившихся» из-за таких малых РНК, встречаются регуляторы глобальных метаболических путей, что позволяет многократно усиливать ингибирующий сигнал малой РНК. К примеру, так делает малая РНК 6S, «имитирующая» белковый фактор σ 70 . Конфигурационным «обманом» занимая центры связывания РНК-полимеразы с сигма-фактором, она запрещает экспрессию генов «домашнего хозяйства» .

Рисунок 1. Биоинформатически предсказанная вторичная структура малой РНК CsrB из Vibrio cholerae M66-2. Малые РНК - одноцепочечные молекулы, но, как и для других РНК, сворачивание (фолдинг) в стабильную пространственную структуру сопровождается формированием участков, где молекула гибридизуется сама на себя. Многочисленные изгибы на структуре в виде разомкнутых колец называются шпильками . В некоторых случаях комбинация шпилек позволяет РНК играть роль «губки», нековалентно связывая определенные белки. Но чаще молекулы такого типа интерферируют с ДНК или РНК; при этом пространственная структура малой РНК нарушается, и образуются новые участки гибридизации уже с молекулой-мишенью. Тепловая карта отражает вероятность того, что соответствующая пара нуклеотидов действительно будет связана внутримолекулярной водородной связью; для неспаренных участков - вероятность образовать водородные связи с какими-либо участками внутри молекулы. Изображение получено с помощью программы RNAfold .

Малые РНК бактерий интерферируют... и весьма успешно!

Механизм, по которому действуют регуляторы второй группы, в общем-то, схож с таковым у регуляторных РНК эукариот - это та же РНК-интерференция путем гибридизации с мРНК, только сами цепочки малых РНК зачастую подлиннее - до нескольких сотен нуклеотидов (см. рис. 1). В результате, из-за малой РНК рибосомы не могут считать информацию с мРНК. Хотя зачастую, похоже, не доходит и до этого: образовавшиеся комплексы «малая РНК - мРНК» становятся мишенью РНКаз (типа РНКазы Р) .

Компактность и плотность упаковки прокариотического генома дает о себе знать: если у эукариот большинство регуляторных РНК записаны в отдельных (чаще всего не кодирующих белок) локусах , то многие малые РНК бактерий могут кодироваться в том же участке ДНК, что и подавляемый ген, но на противолежащей цепи! Такие РНК называются цис-кодируемыми (антисмысловыми), а малые РНК, лежащие на некотором удалении от подавляемого участка ДНК - транс-кодируемыми . По-видимому, расположение цис-РНК можно считать торжеством эргономичности: они могут считываться с противолежащей цепи ДНК в момент ее расплетения одновременно с транскриптом-мишенью, что позволяет тонко управлять количеством синтезируемого белка.

Малые РНК в транс-положении эволюционируют независимо от целевой мРНК, и последовательность регулятора сильнее меняется в результате мутаций. Возможно, такой расклад бактериальной клетке только «на руку», поскольку малая РНК приобретает активность в отношении ранее несвойственных ей мишеней, что сокращает время и энергетические затраты на создание других регуляторов. С другой стороны, давление отбора не позволяет транс-малой РНК мутировать слишком сильно, поскольку она потеряет активность. Тем не менее, для гибридизации с матричной РНК большинству транс-малых РНК необходим помощник - белок Hfq. По-видимому, в противном случае неполная комплементарность малой РНК может создавать проблемы для связывания с мишенью.

По-видимому, потенциально реализуемый механизм регуляции по принципу «одна малая РНК - множество мишеней» помогает интегрировать метаболические сети бактерии, что крайне необходимо в условиях короткой одноклеточной жизни. Можно продолжить спекуляцию на тему и предположить, что с помощью транс-кодируемых малых РНК осуществляется пересылка экспрессионных «предписаний» из функционально связанных, но физически удаленных локусов. Необходимостью в подобного рода генетической «перекличке» логично объясняется большое количество малых РНК, обнаруженных у патогенных бактерий. Например, несколько сотен малых РНК найдено у рекордсмена по этому показателю - холерного вибриона (Vibrio cholerae ). Это микроорганизм, который умеет выживать и в окружающей водной среде (как пресной, так и соленой), и на водных моллюсках, и в рыбе, и в кишечнике человека - тут без комплексной адаптации с помощью регуляторных молекул никак не обойтись!

CRISPR на страже бактериального здоровья

Нашлось применение малым РНК и в решении другой насущной для бактерий задаче. Даже самые злостные патогенные кокки и палочки могут оказаться бессильны перед лицом опасности, исходящей от особых вирусов - бактериофагов, способных молниеносно истребить бактериальную популяцию. У многоклеточных организмов для защиты от вирусов существует специализированная система - иммунная , средствами клеток и выделяемых ими веществ охраняющая организм от незваных гостей (в том числе, вирусной природы). Бактериальная клетка - одиночка, но она не так уязвима, как может показаться на первый взгляд. Хранителями рецептов для поддержания противовирусного иммунитета бактерий выступают локусы CRISPR - кластерные регулярно-прерывистые короткие палиндромные повторы (clustered regularly interspaced short palindromic repeats ) (рис. 2; ). В геномах прокариот каждая CRISPR-кассета представлена лидерной последовательностью длиной несколько сотен нуклеотидов, за которой следует серия из 2–24 (иногда до 400) повторов, разделенных спейсерными участками, схожими между собой по длине, но уникальными по нуклеотидной последовательности. Длина каждого спейсера и повтора не превышает сотню пар нуклеотидов .

Рисунок 2. CRISPR-локус и процессинг соответствующей ему малой РНК до функционального транскрипта. В геноме CRISPR -кассета представлена перемежающимися между собой спейсерами (на рисунке обозначены как Сп ), частично гомологичными участкам фаговой ДНК, и повторами (По ) длиной 24–48 п.н., демонстрирующими диадную симметрию . В противоположность повторам, спейсеры внутри одного локуса одинаковы по длине (у разных бактерий это может быть 20–70 нуклеотидов), но отличаются по нуклеотидной последовательности. Участки «-спейсер-повтор-» могут быть достаточно протяженными и состоять из нескольких сотен звеньев. Вся структура фланкируется с одной стороны лидерной последовательностью (ЛП , несколько сотен пар оснований). Неподалеку находятся Cas-гены (C RISPR -as sociated), организованные в оперон. Белки, считываемые с них, выполняют ряд вспомогательных функций, обеспечивая процессинг транскрипта, считанного с CRISPR -локуса, его успешную гибридизацию с фаговой ДНК-мишенью, встраивание новых элементов в локус и т.д. Образующаяся в результате многоэтапного процессинга СrRNA гибридизуется с участком ДНК (нижняя часть рисунка), впрыскиваемой фагом в бактерию. Это заставляет «замолчать» транскрипционную машину вируса и останавливает его размножение в прокариотической клетке.

Детальный механизм возникновения всего CRISPR -локуса еще предстоит изучить. Но на сегодняшний день предложена принципиальная схема возникновения спейсеров - важнейших структур в его составе. Оказывается, «охотники за бактериями» оказываются биты их же оружием - нуклеиновыми кислотами, а точнее - «трофейной» генетической информацией, полученной бактериями от фагов в прежних сражениях! Дело в том, что не все фаги, попавшие в бактериальную клетку, оказываются гибельными. ДНК таких фагов (возможно, относящихся к умеренным) режется специальными Cas-белками (их гены фланкируют CRISPR ) на мелкие фрагменты. Часть этих фрагментов будет встроена в CRISPR -локусы «хозяйского» генома. И когда фаговая ДНК вновь попадает в бактериальную клетку, она встречается с малой РНК из CRISPR -локуса, в тот момент экспрессируемой и обрабатываемой Cas-белками. Вслед за этим происходит инактивация вирусной генетической информации по уже описанному выше механизму РНК-интерференции .

Из гипотезы формирования спейсеров неясно, зачем между ними нужны повторы, внутри одного локуса незначительно отличающиеся по длине, но практически идентичные по последовательности? Здесь открывается широкий простор для фантазии. Быть может, без повторов было бы проблематично осуществить разбиение генетических данных на смысловые фрагменты, подобные секторам на жестком диске компьютера, и тогда доступ транскрипционной машины к строго определенным участкам CRISPR -локуса стал бы затруднительным? А быть может, повторы упрощают рекомбинационные процессы при встраивании новых элементов фаговой ДНК? Или же они - «знаки препинания», без которых не обойтись при процессинге CRISPR? Как бы то ни было, биологическая причина, объясняющая поведение бактериальной клетки на манер гоголевского Плюшкина, в свое время будет найдена.

CRISPR , будучи «летописью» взаимоотношений бактерии с фагом, может использоваться в филогенетических исследованиях. Так, недавно осуществленное типирование по CRISPR позволило окинуть взглядом эволюцию отдельных штаммов чумного микроба (Yersinia pestis ). Исследование их CRISPR -«родословных» пролило свет на события полутысячелетней давности, когда штаммы проникли в Монголию с территории, в настоящее время относящейся к Китаю . Но не для всех бактерий, и, в частности, патогенов, данный метод применим. Несмотря на недавние сведения о предсказанных CRISPR-обрабатывающих белках у возбудителей туляремии (Francisella tularensis ) и холеры , сами CRISPR, если и присутствуют в их геноме, то немногочисленны. Возможно, фаги, учитывая их положительный вклад в приобретение вирулентности патогенными представителями бактериального царства, не так уж вредны и опасны, чтобы обороняться от них с помощью CRISPR? Или же вирусы, атакующие эти бактерии, слишком многообразны, и стратегия «интерферирующего» РНК-иммунитета в отношении них бесплодна?

Рисунок 3. Некоторые механизмы работы рибосвитчей. Рибосвитчи (рибопереключатели) встроены в матричную РНК, но отличаются большой свободой конформационного поведения, зависящего от специфичных лигандов, что дает основание считать рибосвитчи самостоятельными единицами малых РНК. Изменение конформации экспрессионной платформы влияет на сайт посадки рибосомы на мРНК (RBS ), и, как следствие, определяет доступность всей мРНК для считывания. Рибосвитчи в известной степени аналогичны операторной области в классической модели lac -оперона - но только аптамерные участки обычно регулируются низкомолекулярными веществами и осуществляют переключение работы гена на уровне мРНК, а не ДНК. а - В отсутствие лигандов рибосвитчи btuB (кобаламинового транспортера) и thiM (тиаминпирофосфат-зависимый) , осуществляющие ненуклеолитическую репрессию мРНК, «включаются» (ON ) и позволяют рибосоме заняться своим делом. Связывание лиганда с рибосвитчем (OFF -положение) приводит формированию шпильки, делающей этот участок недоступным для рибосомы. б - Лизиновый рибосвитч lysC при отсутствии лиганда также включен (ON ). Выключение рибосвитча блокирует рибосоме доступ к мРНК. Но в отличие от описанных выше рибосвитчей, в лизиновом при выключении «оголяется» участок, разрезаемый специальным РНКазным комплексом (degradosome ), и вся мРНК утилизируется, распадаясь на мелкие фрагменты. Репрессия рибосвитчем в данном случае называется нуклеолитической (nucleolytic ) и необратима, поскольку, в отличие от примера (а ), обратное переключение (снова в ON ) уже невозможно. Важно отметить, что таким образом может достигаться утилизация группы «ненужных» мРНК: рибосвитч похож на деталь детского конструктора, и схожие по структуре переключатели могут иметься у целой группы функционально связанных матричных молекул.

Рибосвитч - датчик для бактерии

Итак, есть белок-ассоциирующие малые РНК, есть малые РНК, интерферирующие с собственными мРНК бактерий, а также РНК, захваченные бактериями из вирусов и подавляющие фаговую ДНК. Разве можно вообразить какой-нибудь еще механизм регуляции с помощью малых РНК? Оказывается, да. Если проанализировать описанное выше, то обнаружится, что во всех случаях антисмысловой регуляции наблюдается интерференция малой РНК и мишени как результат гибридизации двух отдельных молекул. А почему бы не расположить малую РНК в составе самого транскрипта ? Тогда можно, изменяя конформацию такого «засланного казачка» внутри мРНК, менять доступность всей матрицы для считывания при трансляции или же, что энергетически еще более целесообразно, регулировать биосинтез мРНК, т.е. транскрипцию!

Такие структуры широко представлены в бактериальных клетках и известны как рибосвитчи (riboswitch ). Они располагаются перед началом кодирующей части гена, на 5′-конце мРНК. Условно в составе рибосвитчей можно выделить два структурных мотива: аптамерный участок , ответственный за связывание с лигандом (эффектором), и экспрессионную платформу , обеспечивающую регуляцию экспрессии гена посредством перехода мРНК в альтернативные пространственные структуры . Например, такой переключатель («выключающего» типа) используется для функционирования лизинового оперона : при избытке лизина он существует в виде «запутанной» пространственной структуры, блокирующей считывание с оперона, а при его нехватке рибосвитч «расплетается», и синтезируются белки, необходимые для биосинтеза лизина (рис. 3).

Описанная принципиальная схема устройства рибосвитча - не канон, существуют варианты. Любопытный «включающий» тандемный рибосвитч обнаружен у холерного вибриона: экспрессионной платформе предшествуют сразу два аптамерных участка. Очевидно, это обеспечивает бóльшую чувствительность и более плавный ответ на появление в клетке еще одной аминокислоты - глицина . Возможно, косвенно причастен к высокой выживаемости бактерии схожий по принципу действия, но «двойной» рибосвитч в геноме возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis ). Он реагирует на входящее в состав минимальной среды жизненно важное для этого микроба соединение - тиаминпирофосфат .

Помимо переключения метаболических путей в зависимости от доступного для бактериальной клетки «меню», рибосвитчи могут быть датчиками гомеостаза бактерии. Так, они были замечены в регуляции доступности гена для считывания при нарушении функционирования трансляционной системы внутри клетки (например, такие сигналы как появление «незаряженных» тРНК и «неисправных» (stalled) рибосом), либо при изменении факторов внешней среды (например, повышении температуры) .

Не нужно белков, дайте нам РНК!

Так что же означает присутствие такого разнообразия малых РНК-регуляторов внутри бактерии? Свидетельствует ли это об отказе от концепции, когда главными «управленцами» являются белки, или мы наблюдаем очередной модный тренд? Видимо, ни то, и ни другое. Конечно, некоторые малые РНК являются глобальными регуляторами метаболических путей - как упомянутая CsrB, участвующая, вкупе с CsrС, в регуляции запасания органического углерода. Но, принимая во внимание принцип дублирования функций в биологических системах, малые РНК бактерий можно сравнить скорее с «антикризисным менеджером», чем с генеральным директором. Так, в условиях, когда для выживания микроорганизма нужно быстро перенастроить внутриклеточный метаболизм, их регуляторная роль может оказаться решающей и более эффективной, чем у белков с аналогичными функциями. Таким образом, РНК-регуляторы отвечают, скорее, за экспресс-реагирование, менее стойкое и надежное, чем в случае с белками: не следует забывать, что малая РНК поддерживает свою 3D-структуру и удерживается на ингибируемой матрице слабыми водородными связями.

Косвенным подтверждением этих тезисов могут стать уже упоминавшиеся малые РНК холерного вибриона. Для этой бактерии попадание в организм человека - не желанная цель, а, видимо, чрезвычайная ситуация. Выработка токсинов и активация других, связанных с вирулентностью, путей в данном случае - всего лишь защитная реакция на агрессивное противодействие среды и клеток организма «чужакам». «Спасателями» здесь выступают малые РНК - например Qrr, помогающие вибриону в стрессовых условиях модифицировать стратегию выживания, изменяя коллективное поведение . Косвенно подтвердить эту гипотезу может также открытие малой РНК VrrA, активно синтезирующейся при нахождении вибрионов в организме и подавляющей наработку мембранных белков Omp . «Спрятанные» мембранные белки в начальной фазе инфицирования, возможно, помогают избежать мощного иммунного ответа со стороны организма человека (рис. 4).

Рисунок 4. Малые РНК в реализации патогенных свойств холерного вибриона. а - Холерный вибрион хорошо чувствует себя и прекрасно размножается в водной среде. Организм человека, вероятно, не является основной экологической нишей для этого микроба. б - Попадая по водному или пищевому пути передачи инфекции в агрессивную среду - тонкий кишечник человека, - вибрионы по организованности поведения начинают напоминать псевдоорганизм, основная задача которого - сдержать иммунный ответ и создать себе благоприятную среду для колонизации. Большое значение в координации действий внутри популяции бактерий и их взаимодействия с организмом отводится мембранным везикулам. До конца неизученные факторы среды в кишечнике являются сигналами для экспрессии в вибрионах малых РНК (например, VrrA). В результате запускается механизм образования везикул, являющихся неиммунногенными при низком числе клеток вибриона в кишечнике. Дополнительно к описанному эффекту малые РНК помогают «спрятать» потенциально провокационные для иммунной системы человека мембранные белки Omp. При косвенном участии малых РНК Qrr1-4 запускается интенсивная выработка холерного токсина (не показано на рисунке), что дополняет спектр адаптивных реакций холерного вибриона. в - Уже через несколько часов количество бактериальных клеток возрастает, а пул малых РНК VrrA уменьшается, что, вероятно, приводит к экспонированию мембранных белков. Количество «пустых» везикул также постепенно уменьшается, и на этом этапе они заменяются на иммунногенные, доставляемые в энтероциты . Видимо, это часть «плана» по реализации комплексного сигнала, смысл которого - спровоцировать эвакуацию вибрионов из организма человека. NB: соотношение размеров бактериальных клеток и энтероцитов не соблюдено.

Интересно проследить, как изменятся наши представления о малых РНК-регуляторах, когда будут получены новые данные на платформах RNAseq, в том числе, по свободноживущим и некультивируемым формам. Недавние работы с использованием «глубокого секвенирования» уже дали неожиданные результаты, указав на наличие микроРНК-подобных молекул у мутантных стрептококков . Конечно, такие данные нуждаются в тщательной перепроверке, но, как бы то ни было, можно с уверенностью утверждать, что изучение малых РНК у бактерий преподнесет немало сюрпризов.

Благодарности

Оригинальные идеи и композиционное оформление при создании заглавного рисунка, а также рисунка 4 принадлежат выпускнице ИархиИ ЮФУ Копаевой Е.А. Наличие в статье рисунка 2 - заслуга доцента каф. зоологии ЮФУ Г.Б. Бахтадзе. Он же осуществил научную корректуру и доработку заглавного рисунка и рисунка 4. Автор выражает им огромную признательность за терпение и творческий подход к делу. Отдельная благодарность коллеге, с.н.с. лаб. биохимии микробов Ростовского противочумного института Сорокину В.М. за обсуждение текста статьи и высказанные ценные замечания.

Литература

1. Карл Вёзе (1928–2012) ;;. 80 , 1148-1154;
2. R. R. Breaker. (2012). Riboswitches and the RNA World . Cold Spring Harbor Perspectives in Biology . 4 , a003566-a003566;
3. J. Patrick Bardill, Brian K. Hammer. (2012). Non-coding sRNAs regulate virulence in the bacterial pathogen Vibrio cholerae . RNA Biology . 9 , 392-401;
4. Heon-Jin Lee, Su-Hyung Hong. (2012). Analysis of microRNA-size, small RNAs in Streptococcus mutans by deep sequencing . FEMS Microbiol Lett . 326 , 131-136;
5. M.-P. Caron, L. Bastet, A. Lussier, M. Simoneau-Roy, E. Masse, D. A. Lafontaine. (2012). Dual-acting riboswitch control of translation initiation and mRNA decay . Proceedings of the National Academy of Sciences . 109 , E3444-E3453.

Как полагают ученые, неверная экспрессия малых РНК служит одной из причин целого ряда заболеваний, очень серьезно влияющих на здоровье множества людей во всем мире. В числе таких заболеваний - сердечно-сосудистые 23 и онкологические 24 . Что касается последних, то это неудивительно: рак свидетельствует об аномалиях в развитии клеток и в их судьбе, а малые РНК играют важнейшую роль в соответствующих процессах. Вот один из весьма показательных примеров огромного влияния, которое малые РНК оказывают на организм при онкологических заболеваниях. Речь идет о злокачественной опухоли, для которой характерна неверная экспрессия тех генов, которые действуют в период первоначального развития организма, а не в постнатальный период. Это разновидность детской опухоли мозга, обычно появляющаяся еще до двухлетнего возраста. Увы, это очень агрессивная форма рака, и прогноз здесь неблагоприятен даже при интенсивном лечении . Онкологический процесс развивается вследствие неправильного перераспределения генетического материала в клетках мозга. Промотор, который обычно вызывает сильную экспрессию одного из генов, кодирующих белки, претерпевает рекомбинацию с определенным кластером малых РНК. Затем весь этот перестроенный участок проходит амплификацию: иными словами, создается множество его копий в геноме. А следовательно, малые РНК, расположенные «ниже по течению», чем перемещенный промотор, экспрессируются гораздо сильнее, чем следует. Уровень содержания активных малых РНК при этом примерно в 150-1000 раз выше нормы.

Рис. 18.3. Малые РНК, активированные алкоголем, могут соединяться с информационными РНК, не влияющими на устойчивость организма к воздействию алкоголя. Но эти малые РНК не соединяются с молекулами информационной РНК, способствующими такой устойчивости. Это приводит к относительному преобладанию доли молекул информационной РНК, кодирующих вариации белка, связанные с устойчивостью к алкоголю.

Данный кластер кодирует более 40 различных малых РНК. Собственно, это вообще самый крупный из подобных кластеров, имеющихся у приматов. Обычно он экспрессируется лишь на ранней стадии человеческого развития, в первые 8 недель жизни эмбриона. Сильная активация его в мозгу младенца приводит к катастрофическому воздействию на генетическую экспрессию. Одно из последствий - экспрессия эпигенетического белка, добавляющего модификации к ДНК. Это приводит к широкомасштабным изменениям во всей картине метилирования ДНК, а значит, и к аномальной экспрессии всевозможных генов, многие из которых должны экспрессироваться, лишь когда незрелые клетки мозга делятся в ходе ранних этапов развития организма. Так в клетках младенца и запускается раковая программа 25 .

Подобное общение между малыми РНК и эпигенетической аппаратурой клетки может оказывать существенное влияние и на другие ситуации, когда в клетках развивается предрасположенность к раку. Данный механизм, вероятно, приводит к тому, что воздействие нарушения экспрессии малых РНК усиливается путем изменения эпигенетических модификаций, которые передаются дочерним клеткам от материнской. Так может складываться схема потенциально опасных изменений в характере экспрессии генов.

Пока ученые разобрались не во всех этапах взаимодействия малых РНК с эпигенетическими процессами, но кое-какие намеки на особенности происходящего все-таки удается получить. К примеру, выяснилось, что определенный класс малых РНК, усиливающий агрессивность рака груди, таргетирует в информационных РНК определенные ферменты, удаляющие ключевые эпигенетические модификации. Это изменяет картину эпигенетических модификаций в раковой клетке и еще больше нарушает генетическую экспрессию 26 .

Многие формы рака отслеживать у пациента довольно трудно. Онкологические процессы могут идти в труднодоступных местах, что осложняет процедуру отбора проб. В таких случаях врачу нелегко следить за развитием ракового процесса и реакцией на лечение. Часто медики вынуждены полагаться на косвенные измерения - скажем, на томографическое сканирование опухоли. Некоторые исследователи полагают, что молекулы малых РНК могли бы помочь создать новую методику наблюдения за развитием опухоли, позволяющую также изучать ее происхождение. Когда раковые клетки погибают, при разрыве клетки ее покидают малые РНК. Эти небольшие мусорные молекулы часто образуют комплексы с клеточными белками или же завертываются во фрагменты клеточных мембран. Благодаря этому они очень стабильны в жидких средах организма, а значит, такие РНК можно выделить и проанализировать. Поскольку их количества невелики, исследователи вынуждены будут использовать весьма чувствительные методы анализа. Впрочем, тут нет ничего невозможного: чувствительность секвенирования нуклеиновых кислот постоянно повышается 27 . Опубликованы данные, подтверждающие перспективность такого подхода применительно к раку груди 28 , раку яичников 29 и ряду других онкологических заболеваний. Анализ малых циркулирующих РНК у больных раком легких показал, что эти РНК помогают провести различие между пациентами с одиночным легочным узелком (не требующие терапии) и пациентами, у которых образуются злокачественные узелки-опухоли (требующие лечения) 30 .

Метафора, лежащая в основе названия явления РНК-интерференции, отсылает к опыту с петунией, когда искусственно введённые в растение гены синтетазы розового и фиолетового пигментов не увеличили интенсивность окраски, а, наоборот, уменьшили её. Аналогично, в «обычной» интерференции наложение двух волн может приводить к взаимному «гашению».

В живой клетке поток информации между ядром и цитоплазмой никогда не иссякает, однако понимание всех его «завихрений» и расшифровка закодированной в нём информации – воистину титаническая задача. Одним из важнейших рывков в биологии прошлого века можно считать открытие молекул информационных (или матричных) РНК (иРНК или мРНК), которые служат посредниками, переносящими информационные «сообщения» из ядра (с хромосом) в цитоплазму. Определяющая роль РНК в синтезе белков была предсказана ещё в 1939 году в работе Торбьёрна Касперссона (Torbjörn Caspersson), Жана Брачета (Jean Brachet) и Джека Шульца (Jack Schultz), а в 1971 году Джордж Марбайс (George Marbaix) запустил синтез гемоглобина в ооцитах лягушки, сделав инъекцию впервые выделенной матричной РНК кролика, кодирующей этот белок .

В 1956-57 годах в Советском Союзе А. Н. Белозерский и А. С. Спирин независимо доказали существование мРНК, а также выяснили, что основную массу РНК в клетке составляет отнюдь не матричная, а рибосомальная РНК (рРНК). Рибосомальная РНК – второй «главный» вид клеточной РНК – образует «скелет» и функциональный центр рибосом у всех организмов; именно рРНК (а не белки) регулирует основные этапы белкового синтеза. Одновременно был описан и изучен и третий «главный» вид РНК – транспортные РНК (тРНК), которые в комплексе с двумя другими – мРНК и рРНК – формируют единый белок-синтезирующий комплекс. Согласно достаточно популярной гипотезе «мира РНК», именно эта нуклеиновая кислота лежала у самых истоков жизни на Земле .

В связи с тем, что РНК значительно более гидрофильна по сравнению с ДНК (за счет замены дезоксирибозы на рибозу), она более лабильна и может относительно свободно перемещаться в клетке, а значит и доставлять короткоживущие реплики генетической информации (мРНК) к месту, где начинается белковый синтез. Однако стоит отметить и связанное с этим «неудобство» – РНК очень нестабильна. Она намного хуже, чем ДНК, хранится (даже внутри клетки) и деградирует при малейшей перемене условий (температура, рН). Кроме «собственной» нестабильности, большой вклад принадлежит рибонуклеазам (или РНКазам) – классу расщепляющих РНК ферментов, очень стабильных и «вездесущих» – даже кожа рук экспериментатора содержит достаточное количество этих ферментов, чтобы перечеркнуть весь эксперимент. Из-за этого работать с РНК намного сложнее, чем с белками или ДНК – последняя вообще может храниться сотни тысяч лет практически без повреждений .

Фантастическая аккуратность при работе, тридистиллят, стерильные перчатки, одноразовая лабораторная посуда – всё это необходимо для предотвращения деградации РНК, однако соблюдение таких стандартов не всегда было возможным. Поэтому долгое время на короткие «обломки» РНК, неизбежно загрязнявшие растворы, попросту не обращали внимания. Однако со временем стало ясно, что, несмотря на все усилия по поддержанию стерильности рабочей области, «обломки» закономерно продолжали обнаруживаться, а потом выяснилось, что в цитоплазме всегда присутствуют тысячи коротких двуцепочечных РНК, выполняющих вполне определённые функции, и абсолютно необходимых для нормального развития клетки и организма.

Принцип РНК-интерференции

Сегодня изучение малых регуляторных РНК является одной из наиболее бурно развивающихся областей молекулярной биологии. Обнаружено, что все короткие РНК выполняют свои функции на основе явления, названного РНК-интерференцией (суть этого феномена заключается в подавлении экспрессии гена на стадии транскрипции или трансляции при активном участии малых молекул РНК). Очень схематично механизм РНК-интерференции показан на рис.1:

Рис. 1. Основы РНК-интерференции
Двуцепочечные молекулы РНК (дцРНК) нехарактерны для нормальных клеток, но они являются обязательным этапом жизненного цикла многих вирусов. Специальный белок Dicer, обнаружив в клетке дцРНК, «режет» её на небольшие фрагменты. Антисмысловая цепь такого фрагмента, которую уже можно называть короткой интерферирующей РНК (киРНК, от siRNA – small interference RNA), связывается комплексом белков под названием RISC (RNA-induced silencing complex), центральный элемент которого – эндонуклеаза семейства Argonaute. Связывание с киРНК активирует RISC и запускает в клетке поиск молекул ДНК и РНК, комплементарных «шаблонной» киРНК. Судьба таких молекул – быть уничтоженными или инактивированными комплексом RISC.

Подытоживая, короткие «обрезки» чужеродной (в том числе, введённой намеренно) двуцепочечной РНК служат «шаблоном» для широкомасштабного поиска и уничтожения комплементарных мРНК (а это эквивалентно подавлению экспрессии соответствующего гена), – причем, не только в одной клетке, но и в соседних. Для многих организмов – простейших, моллюсков, червей, насекомых, растений – этот феномен является одним из основных способов иммунной защиты против инфекций.

В 2006 году Эндрю Файер (Andrew Fire) и Крейг Мелло (Craig Mello) получают Нобелевскую премию по физиологии и медицине «За открытие явления РНК-интерференции – механизма сайленсинга генов при участии дцРНК». Хотя сам феномен РНК-интерференции был описан задолго до того (ещё в начале 1980-х), именно работы Файера и Мелло в общих чертах определили регуляторный механизм малых РНК и обрисовали неведомую до той поры область молекулярных исследований. Вот основные результаты их работ:

• При РНК-интерференции расщепляется именно мРНК (и никакая другая);
• Двуцепочечная РНК действует (вызывает расщепление) значительно эффективнее одноцепочечной. Эти два наблюдения предсказывали существование специализированной системы, опосредующей действие дцРНК;
• дцРНК, комплементарная участку зрелой мРНК, вызывает расщепление последней. Это указывало на цитоплазматическую локализацию процесса и наличие специфической эндонуклеазы;
• Небольшого количества дцРНК (нескольких молекул на клетку) достаточно для полного «выключения» целевого гена, что указывает на существование каскадного механизма катализа и/или амплификации.

Эти результаты заложили фундамент целому направлению современной молекулярной биологии – РНК-интерференции – и определили вектор работы множества исследовательских групп по всему миру не на один десяток лет. К текущему моменту обнаружено три большие группы малых РНК, которые играют на молекулярном поле за «команду РНК-интерференции». Познакомимся с ними подробнее.

Игрок № 1 – короткие интерферирующие РНК

Специфичность РНК-интерференции определяется короткими интерферирующими РНК (киРНК) – небольшими двуцепочечными молекулами РНК с чётко определённой структурой (см. рис.2).

киРНК эволюционно наиболее ранние, и распространены шире всего у растений, одноклеточных организмов и беспозвоночных . У позвоночных в норме киРНК практически не обнаружены, потому что их вытеснили более поздние «модели» коротких РНК (см. далее).

киРНК – «шаблоны» для поиска в цитоплазме и уничтожения молекул мРНК – имеют длину 20–25 нуклеотидов и «особую примету»: по 2 неспаренных нуклеотида на 3’-концах и фосфорилированные 5’-концы. Анти-смысловая киРНК способна (не сама, конечно, а с помощью RISC-комплекса) распознавать мРНК и специфически вызывать её деградацию: разрез целевой мРНК всегда происходит точно в месте, комплементарном 10 и 11 нуклеотидам анти-смысловой цепи киРНК.

Рис. 2. Механизм «интерференции» мРНК и киРНК
«Интерферирующие» короткие молекулы РНК могут как попадать в клетку извне, так и «нарезаться» уже на месте из более длинных двуцепочечных РНК. Основной белок, необходимый для «нарезания» дцРНК, – эндонуклеаза Dicer. «Выключение» гена по механизму интерференции осуществляется киРНК совместно с белковым комплексом RISC, который состоит из трёх белков – эндонуклеазы Ago2 и двух вспомогательных белков PACT и TRBP. Позже было обнаружено, что комплексы Dicer и RISC могут использовать в качестве «затравки» не только дцРНК, но и одноцепочечную РНК, формирующую двуцепочечную шпильку, а также готовую киРНК (последняя минует стадию «нарезания» и сразу связывается с RISC).

Функции киРНК в клетках беспозвоночных достаточно разнообразны. Первая и основная – это иммунная защита. «Традиционная» иммунная система (лимфоциты + лейкоциты + макрофаги) присутствует лишь у сложных многоклеточных организмов. У одноклеточных же, беспозвоночных и растений (у которых такой системы либо нет, либо она находится в зачаточном состоянии) иммунная защита строится на основе РНК-интерференции. Иммунитет, основанный на РНК-интерференции, не нуждается в сложных органах «тренировки» предшественников иммунных клеток (селезенка, тимус); в то же время, многообразие теоретически возможных последовательностей коротких РНК (421 вариантов) соотносимо с числом возможных белковых антител высших животных. Кроме того, киРНК синтезируются на основе инфицировавшей клетку «враждебной» РНК, а значит, в отличие от антител, они сразу «затачиваются» под конкретный тип инфекции. И хотя вне клетки защита на основе РНК-интерференции не работает (по крайней мере, таких данных пока нет), внутриклеточный иммунитет она обеспечивает более чем удовлетворительно.

Прежде всего, киРНК создаёт антивирусный иммунитет, уничтожая мРНК или геномную РНК инфекционных организмов (например, так киРНК и были открыты у растений ). Введение вирусной РНК вызывает мощную амплификацию специфических киРНК на основе молекулы-затравки – самой вирусной РНК. Кроме того, киРНК подавляют экспрессию различных мобильных генетических элементов (МГЭ), а значит, обеспечивает защиту и от эндогенных «инфекций». Мутации в генах RISC-комплекса часто ведут к повышению нестабильности генома из-за высокой активности МГЭ; киРНК может быть ограничителем экспрессии собственных генов, срабатывая в ответ на их гиперэкспрессию. Регуляция работы генов может происходить не только на уровне трансляции, но и во время транскрипции – через метилирование генов по гистону Н3.

В современной экспериментальной биологии значение РНК-интерференции и коротких РНК трудно переоценить. Разработана технология «выключения» (или нокдауна) отдельных генов in vitro (на культурах клеток) и in vivo (на эмбрионах), что уже стало стандартом de facto при изучении любого гена. Иногда даже, чтобы установить роль отдельных генов в каком-нибудь процессе, проводят систематическое «выключение» всех генов по очереди .

Возможностью применения киРНК заинтересовались и фармацевты, поскольку способность направленной регуляции работы отдельных генов сулит неслыханные перспективы в лечении массы заболеваний. Небольшой размер и высокая специфичность действия обещают высокую эффективность и низкую токсичность лекарств на основе киРНК; однако решить проблему доставки киРНК к больным клеткам в организме пока не удалось – виной тому хрупкость и недолговечность этих молекул. И хотя сейчас десятки коллективов пытаются найти способ направлять эти «волшебные пули» точно в цель (внутрь больных органов), видимых успехов они пока не достигли. Кроме этого, есть и другие сложности. Например, в случае антивирусной терапии высокая избирательность действия киРНК может оказать «медвежью услугу» – поскольку вирусы быстро мутируют, изменённый штамм очень быстро потеряет чувствительность к киРНК, подобранной в начале терапии: известно, что замена всего лишь одного нуклеотида в киРНК приводит к существенному снижению эффекта интерференции.

В этом месте стоит напомнить ещё раз – киРНК были обнаружены только у растений, беспозвоночных и одноклеточных; хотя гомологи белков для РНК-интерференции (Dicer, RISC-комплекс) присутствуют и у высших животных, киРНК привычными методами не обнаруживались. Каково же было удивление, когда искусственно введённые синтетические аналоги киРНК вызывали сильный специфический дозозависимый эффект в культурах клеток млекопитающих! Это означало, что в клетках позвоночных РНК-интерференция не заместилась более сложными системами иммунитета, а эволюционировала вместе с организмами, превратившись во что-то более «продвинутое». Следовательно, у млекопитающих надо было искать не точные аналоги киРНК, а их эволюционных преемников.

Игрок № 2 – микроРНК

Действительно, на основе эволюционно достаточно древнего механизма РНК-интерференции у более развитых организмов появились две специализированные системы управления работой генов, использующие каждая свою группу малых РНК – микроРНК (microRNA) и пиРНК (piRNA, Piwi-interacting RNA). Обе системы появились ещё у губок и кишечнополостных и эволюционировали вместе с ними, вытеснив киРНК и механизм «голой» РНК-интерференции. Их роль в обеспечении иммунитета снижается, поскольку эту функцию взяли на себя более совершенные механизмы клеточного иммунитета, – в частности, интерфероновая система. Однако эта система настолько чувствительна, что срабатывает и на саму киРНК: появлении в клетке млекопитающих малых двуцепочечных РНК запускает «сигнал тревоги» (активирует секрецию интерферона и вызывает экспрессию интерферон-зависимых генов, что блокирует все процессы трансляции целиком). В этой связи механизм РНК-интерференции у высших животных опосредован в основном микроРНК и пиРНК – одноцепочечными молекулами со специфической структурой, которая не обнаруживаются интерфероновой системой.

По мере усложнения генома микроРНК и пиРНК принимали всё большее участие в регуляции транскрипции и трансляции. Со временем, они превратились в дополнительную, точную и тонкую систему регуляции генома. В отличие от киРНК, микроРНК и пиРНК (открыты в 2001 году, см. рис.3, А-В) не производятся из чужеродных двуцепочечных молекул РНК, а изначально закодированы в геноме организма-хозяина .

Предшественник микроРНК транскрибируется с обеих цепей геномной ДНК РНК-полимеразой II, в результате чего появляется промежуточная форма – при-микроРНК, – несущая признаки обычной мРНК – m7G-кэп и полиА-хвост. В этом предшественнике образуется петля с двумя одноцепочечными «хвостами» и несколькими неспаренными нуклеотидами в центре (рис. 3А). Такая петля подвергается двухстадийному процессингу (рис. Б): вначале эндонуклеаза Drosha отрезает от шпильки одноцепочечные «хвосты» РНК, после чего вырезанная шпилька (пре-микроРНК) экспортируется в цитоплазму, где узнается Dicer’ом, вносящим ещё два разреза (вырезается двуцепочечный участок, обозначенный цветом на рис. 3А). В таком виде зрелая микроРНК, аналогично киРНК, включается в состав комплекса RISC.

Механизм действия многих микроРНК аналогичен действию киРНК: короткая (21–25 нуклеотидов) одноцепочечная РНК в составе белкового комплекса RISC с высокой специфичностью связывается с комплементарным участком в 3’-нетранслируемой области мРНК-мишени. Связывание приводит к расщеплению мРНК белком Ago. Однако активность микроРНК (по сравнению с киРНК) уже более дифференцирована – если комплементарность не абсолютная, целевая мРНК может не деградировать, а только обратимо блокироваться (трансляции не будет). Тот же RISC-комплекс может использовать и искусственно введённые киРНК. Это объясняет, почему киРНК, сделанные по аналогии с простейшими, активны и у млекопитающих.

Таким образом, мы можем дополнить иллюстрацию механизма действия РНК-интерференции у высших (билатерально-симметричных) организмов, объединив на одном рисунке схему действия микроРНК и биотехнологически введённых киРНК (рис. 3В).

Рис. 3А: Структура двуцепочечной молекулы-предшественника микроРНК
Основные особенности: наличие консервативных последовательностей, которые формируют шпильку; наличие комплементарной копии (микроРНК*) с двумя «лишними» нуклеотидами на 3’-конце; специфическая последовательность (2–8 п. н.), формирующая сайт узнавания для эндонуклеаз. Сама микроРНК выделена красным цветом – именно её и вырезает Dicer.

Рис. 3Б: Общий механизм процессинга микроРНК и реализации её активности

Рис. 3В: Обобщённая схема действия искусственных микроРНК и киРНК
Искусственные киРНК вводятся в клетку с помощью специализированных плазмид (targeting siRNA vector).

Функции микроРНК

Физиологические функции микроРНК крайне разнообразны – фактически, они выступают основными небелковыми регуляторами онтогенеза. микроРНК не отменяют, а дополняют «классическую» схему регуляцию генов (индукторы, супрессоры, компактизация хроматина и т. д.). Кроме того, синтез самих микроРНК сложным образом регулируются (определенные пулы микроРНК могут включаться интерферонами, интерлейкинами, фактором некроза опухолей α (ФНО-α) и многими другими цитокинами). В результате вырисовывается потрясающая по своей сложности и гибкости многоуровневая сеть настройки «оркестра» из тысяч генов, но и этим дело не заканчивается.

микроРНК более «универсальны», чем киРНК: «подопечные» гены не обязательно должны быть на 100% комплементарны – регуляция осуществляется и при частичном взаимодействии. На сегодня одна из самых горячих тем в молекулярной биологии – поиск микроРНК, которые выступают альтернативными регуляторами известных физиологических процессов. Например, уже описаны микроРНК, участвующие в регуляции клеточного цикла и апоптоза у растений, дрозофилы и нематоды; у человека микроРНК регулируют иммунную систему и развитие гематопоэтических стволовых клеток . Применение технологий на основе биочипов (micro-array screening) показало, что на различных этапах жизни клеток включаются и выключаются целые пулы малых РНК. Для биологических процессов идентифицировали десятки специфичных микроРНК, уровень экспрессии которых в определённых условиях изменяется в тысячи раз, подчёркивая исключительную управляемость этих процессов.

До недавнего времени считалось, что микроРНК только подавляют – полностью или частично – работу генов. Однако недавно оказалось: действие микроРНК может кардинально отличаться в зависимости от состояния клетки! В активно делящейся клетке микроРНК, связавшись с комплементарной последовательностью в 3’-участке мРНК, ингибирует синтез белка (трансляцию). Однако в состоянии покоя или стресса (например, при росте на бедной среде) то же самое событие приводит к прямо противоположному эффекту – усилению синтеза целевого белка !

Эволюция микроРНК

Количество разновидностей микроРНК у высших организмов ещё до конца не установлено – по некоторым данным, оно превосходит 1% от числа белок-кодирующих генов (у человека, например, говорят о 700 микроРНК, и это число постоянно растет). микроРНК регулируют активность около 30% всех генов (мишени для многих из них пока не известны), причём существуют как повсеместно распространённые, так и тканеспецифичные молекулы – например, один такой важный пул микроРНК регулирует созревание стволовых клеток крови.

Широкий профиль экспрессии в разных тканях разных организмов и биологическая распространённость микроРНК говорит об эволюционно древнем происхождении. Впервые микроРНК обнаружили у нематод, и долгое время потом считали, что эти молекулы появляются лишь у губок и кишечнополостных; однако позже их открыли и в одноклеточных водорослях . Интересно, что по мере усложнения организмов увеличивается также количество и гетерогенность пула микроРНК. Это косвенно свидетельствует о том, что сложность этих организмов обеспечивается, в частности, функционированием микроРНК . Возможная эволюция микроРНК показана на рис.4.

Рис. 4. Многообразие микроРНК у разных организмов
Чем выше организация организма, тем больше у него обнаруживается микроРНК (число в скобках). Красным выделены виды, у которых обнаружены единичные микроРНК. По данным .

Между киРНК и микроРНК можно провести чёткую эволюционную связь, опираясь на следующие факты:

• действие обоих видов взаимозаменяемо и опосредуется гомологичными белками;
• киРНК, введённые в клетки млекопитающих, специфично «выключают» нужные гены (несмотря на некоторую активацию интерфероновой защиты);
• микроРНК обнаруживаются у всё более и более древних организмов.

Эти и другие данные позволяют предположить происхождение обеих систем от общего «предка». Интересно также отметить, что «РНКовый» иммунитет как независимый предшественник белковых антител подтверждает теорию зарождения первых форм жизни на основе РНК, а не белков (напомним, что это любимая теория академика А. С. Спирина ).

Пока на арене молекулярной биологии было только два «игрока» – киРНК и микроРНК – основное «предназначение» РНК-интерференции казалось совершенно понятным. Действительно: набор гомологичных коротких РНК и белков у разных организмов осуществляет аналогичные действия; по мере усложнения организмов усложняется и функциональность.

Однако в процессе эволюции природа создала ещё одну, эволюционно самую позднюю и узкоспециализированную систему на основе всё того же удачного принципа РНК-интерференции. Речь идет пиРНК (piRNA, от Piwi-interaction RNA).

Чем сложнее организован геном, тем более развит и приспособлен организм (или наоборот? ;-). Однако увеличение сложности генома имеет и оборотную сторону: сложная генетическая система становится нестабильной. Это ведет к необходимости механизмов, отвечающих за поддержание целостности генома – иначе самопроизвольное «перемешивание» ДНК просто выведет её из строя. Мобильные генетические элементы (МГЭ) – один из основных факторов нестабильности генома – представляют собой короткие нестабильные участки, которые могут автономно транскрибироваться и мигрировать по геному. Активация таких мобильных элементов приводит к множественным разрывам ДНК в хромосомах, чреватых летальными последствиями.

Количество МГЭ нелинейно увеличивается с размером генома, и их активность необходимо сдерживать. Для этого животные, уже начиная с кишечнополостных, используют всё тот же феномен РНК-интерференции. Эту функцию также выполняют короткие РНК, однако не те, о которых речь уже шла, а третий их тип – пиРНК.

«Портрет» пиРНК

пиРНК – короткие молекулы длиной в 24-30 нуклеотидов, закодированные в центромерных и теломерных областях хромосомы. Последовательности многих из них комплементарны известным мобильным генетическим элементам, однако есть множество других пиРНК, совпадающих с участками рабочих генов или с фрагментами генома, функции которых неизвестны.

пиРНК (также как и микроРНК) закодированы в обеих цепях геномной ДНК; они весьма изменчивы и разнообразны (до 500 000 (!) видов в одном организме). В отличие от киРНК и микроРНК, они образуются одной цепью с характерной особенностью – урацилом (U) на 5’-конце и метилированным 3’-концом. Есть и другие отличия:

• В отличие от киРНК и микроРНК, они не требуют процессинга Dicer’ом;
• Гены пиРНК активны только в зародышевых клетках (во время эмбриогенеза) и окружающих их эндотелиальных клетках;
• Белковый состав системы пиРНК иной – это эндонуклеазы класса Piwi (Piwi и Aub) и отдельная разновидность Argonaute – Ago3.

Процессинг и активность пиРНК пока достаточно плохо изучены, но уже ясно, что механизм действия совершенно отличается от других коротких РНК – сегодня предложена пинг-понг модель их работы (рис.5 А,Б).

Пинг-понг механизм биогенеза пиРНК

Рис. 5А: Цитоплазматическая часть процессинга пиРНК
Биогенез и активность пиРНК опосредуется семейством эндонуклеаз Piwi (Ago3, Aub, Piwi). Активность пиРНК обеспечивается обеими одноцепочечными молекулами пиРНК – смысловой и анти-смысловой, – каждая из которых ассоциирует со специфической эндонуклеазой Piwi. пиРНК узнает комплементарный участок мРНК транспозона (синяя цепь) и вырезает его. Это не только инактивирует транспозон, но и создает новую пиРНК (связанную с Ago3 с помощью метилирования метилазой Hen1 3’-конца). Такая пиРНК, в свою очередь, узнаёт мРНК с транскриптами кластера предшественников пиРНК (красная цепь) – таким способом цикл замыкается и снова вырабатывается нужная пиРНК .

Рис. 5Б: пиРНК в ядре
Кроме эндонуклеазы Aub, антисмысловую пиРНК может связывать и эндонуклеаза Piwi. После связывания комплекс мигрирует в ядро, где вызывает деградацию комплементарных транскриптов и перестройку хроматина, вызывающую подавление активности транспозонов.

Функции пиРНК

Главная функция пиРНК – подавление активности МГЭ на уровне транскрипции и трансляции. Считается, что пиРНК активны только во время эмбриогенеза, когда непредсказуемые перетасовки генома особенно опасны и могут привести к гибели зародыша. Это логично – когда иммунная система ещё не заработала, клетки эмбриона нуждаются в какой-нибудь простой, но действенной защите. От внешних патогенов эмбрион надежно защищен плацентой (или оболочкой яйца). Но кроме этого необходима оборона и от эндогенных (внутренних) вирусов, – в первую очередь МГЭ.

Эта роль пиРНК подтверждена опытом – «нокаут» или мутации генов Ago3, Piwi или Aub приводят к серьёзным нарушениям развития (и резкому увеличению числа мутаций в геноме такого организма), а также вызывают бесплодие за счёт нарушения развития половых клеток.

Распространение и эволюция пиРНК

Первые пиРНК обнаруживаются уже у актиний и губок. Растения, видимо, пошли другим путём – белки Piwi у них не обнаружены, а роль «намордника» для транспозонов выполняют эндонуклеаза Ago4 и киРНК.

У высших животных – в том числе и человека – система пиРНК развита очень хорошо, но встретить её можно только в эмбриональных клетках и в околоплодном эндотелии. Почему распространение пиРНК в организме столь ограничено – ещё предстоит узнать. Можно предположить, что, как и любое мощное оружие, пиРНК приносит пользу только в очень специфических условиях (во время развития плода), а во взрослом организме их активность нанесёт больше вреда, чем пользы. Все-таки, число пиРНК на порядок превосходит количество известных белков – и неспецифические эффекты пиРНК в зрелых клетках сложно предсказать.

Заключение

В заключение хочется привести таблицу, иллюстрирующую эволюцию белкового аппарата, участвующего в РНК-интерференции (рис.6). Видно, что у простейших наиболее развита система киРНК (белковые семейства Ago, Dicer), а с усложнением организмов акцент переносится на более специализированные системы – увеличивается число изоформ белков для микроРНК (Drosha, Pasha) и пиРНК (Piwi, Hen1). При этом разнообразие ферментов, опосредующих действие киРНК, уменьшается.

Рис. 6. Многообразие белков, участвующих в РНК-интерференци и
Цифры обозначают количество белков каждой группы. Синим цветом подсвечены элементы, характерные для киРНК и микроРНК, а красным – белки, связанные с пиРНК. По данным .

Явление РНК-интерференции начали использовать уже простейшие организмы. На основе этого механизма природа создала прототип иммунной системы, а по мере усложнения организмов РНК-интерференция становится незаменимым регулятором активности генома. Два разных механизма плюс три вида коротких РНК (см. сводную таблицу) – в результате мы видим тысячи тонких регуляторов различных метаболических и генетических путей. Эта поразительная картина иллюстрирует универсальность и эволюционную адаптацию молекулярных биологических систем. Короткие РНК снова доказывают, что «мелочей» внутри клетки нет – есть только мелкие молекулы, всю значимость роли которых мы только начинаем понимать.

Правда, такая фантастическая сложность говорит скорее о том, что эволюция «слепа» и действует без наперёд утверждённого «генерального плана» .

Литература

1. Gurdon J.B., Lane C.D., Woodland H.R., Marbaix G. (1971). Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells . Nature 233, 177-182;
2. Спирин А. С. (2001). Биосинтез белков, мир РНК и происхождение жизни . Вестник РАН 71, 320-328;
3. Элементы: «Полные митохондриальные геномы вымерших животных теперь можно извлекать из волос »;
4. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans . Nature 391, 806-311;
5. Биомолекула: «МикроРНК впервые обнаружены в одноклеточном организме »;
6. Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997). Plants combat infection by gene silencing . Nature 385, 781-782;
7. Биомолекула: «Молекулярное двурушничество: гены человека работают на вирус гриппа »;
8. Ren B. (2010). Transcription: Enhancers make non-coding RNA . Nature 465, 173–174;
9. Taganov K.D., Boldin M.P., Chang K.J., Baltimore D. (2006). NF-κB-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses . Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 12481-12486;
10. O’Connell R.M., Rao D.S., Chaudhuri A.A., Boldin M.P., Taganov K.D., Nicoll J., Paquette R.L., Baltimore D. (2008). Sustained expression of microRNA-155 in hematopoietic stem cells causes a myeloproliferative disorder . J. Exp. Med. 205, 585-594;
11. Биомолекула: «микроРНК – чем дальше в лес, тем больше дров »;
12. Элементы: «Усложнение организма у древних животных было связано с появлением новых регуляторных молекул »;
13. Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Early origins and evolution of microRNAs and Piwi-interacting RNAs in animals . Nature 455, 1193–1197.
14. Aravin A., Hannon G, Brennecke J. (2007). The Piwi-piRNA Pathway Provides an Adaptive Defense in the Transposon Arms Race . Science 318, 761–764;
15. Биомолекула: «

В живой клетке поток информации между ядром и цитоплазмой никогда не иссякает, однако понимание всех его «завихрений» и расшифровка закодированной в нём информации - воистину титаническая задача. Одним из важнейших рывков в биологии прошлого века можно считать открытие молекул информационных (или матричных) РНК (иРНК или мРНК), которые служат посредниками, переносящими информационные «сообщения» из ядра (с хромосом) в цитоплазму. Определяющая роль РНК в синтезе белков была предсказана ещё в 1939 году в работе Торбьёрна Касперссона (Torbjörn Caspersson ), Жана Брачета (Jean Brachet ) и Джека Шульца (Jack Schultz ), а в 1971 году Джордж Марбайс (George Marbaix ) запустил синтез гемоглобина в ооцитах лягушки, сделав инъекцию впервые выделенной матричной РНК кролика, кодирующей этот белок .

В 1956–1957 годах в Советском Союзе А. Н. Белозерский и А. С. Спирин независимо доказали существование мРНК, а также выяснили, что основную массу РНК в клетке составляет отнюдь не матричная, а рибосомальная РНК (рРНК). Рибосомальная РНК - второй «главный» вид клеточной РНК - образует «скелет» и функциональный центр рибосом у всех организмов; именно рРНК (а не белки) регулирует основные этапы белкового синтеза. Одновременно был описан и изучен и третий «главный» вид РНК - транспортные РНК (тРНК), которые в комплексе с двумя другими - мРНК и рРНК - формируют единый белок-синтезирующий комплекс. Согласно достаточно популярной гипотезе «мира РНК», именно эта нуклеиновая кислота лежала у самых истоков жизни на Земле .

В связи с тем, что РНК значительно более гидрофильна по сравнению с ДНК (за счет замены дезоксирибозы на рибозу), она более лабильна и может относительно свободно перемещаться в клетке, а значит и доставлять короткоживущие реплики генетической информации (мРНК) к месту, где начинается белковый синтез. Однако стоит отметить и связанное с этим «неудобство» - РНК очень нестабильна. Она намного хуже, чем ДНК, хранится (даже внутри клетки) и деградирует при малейшей перемене условий (температура, рН). Кроме «собственной» нестабильности, большой вклад принадлежит рибонуклеазам (или РНКазам) - классу расщепляющих РНК ферментов, очень стабильных и «вездесущих» - даже кожа рук экспериментатора содержит достаточное количество этих ферментов, чтобы перечеркнуть весь эксперимент. Из-за этого работать с РНК намного сложнее, чем с белками или ДНК - последняя вообще может храниться сотни тысяч лет практически без повреждений .

Фантастическая аккуратность при работе, тридисстилят, стерильные перчатки, одноразовая лабораторная посуда - всё это необходимо для предотвращения деградации РНК, однако соблюдение таких стандартов не всегда было возможным. Поэтому долгое время на короткие «обломки» РНК, неизбежно загрязнявшие растворы, попросту не обращали внимания. Однако со временем стало ясно, что, несмотря на все усилия по поддержанию стерильности рабочей области, «обломки» закономерно продолжали обнаруживаться, а потом выяснилось, что в цитоплазме всегда присутствуют тысячи коротких двуцепочечных РНК, выполняющих вполне определённые функции, и абсолютно необходимых для нормального развития клетки и организма.

Принцип РНК-интерференции

Возможностью применения киРНК заинтересовались и фармацевты, поскольку способность направленной регуляции работы отдельных генов сулит неслыханные перспективы в лечении массы заболеваний. Небольшой размер и высокая специфичность действия обещают высокую эффективность и низкую токсичность лекарств на основе киРНК; однако решить проблему доставки киРНК к больным клеткам в организме пока не удалось - виной тому хрупкость и недолговечность этих молекул. И хотя сейчас десятки коллективов пытаются найти способ направлять эти «волшебные пули» точно в цель (внутрь больных органов), видимых успехов они пока не достигли. Кроме этого, есть и другие сложности. Например, в случае антивирусной терапии высокая избирательность действия киРНК может оказать «медвежью услугу» - поскольку вирусы быстро мутируют, изменённый штамм очень быстро потеряет чувствительность к киРНК, подобранной в начале терапии: известно, что замена всего лишь одного нуклеотида в киРНК приводит к существенному снижению эффекта интерференции.

В этом месте стоит напомнить ещё раз - киРНК были обнаружены только у растений, беспозвоночных и одноклеточных ; хотя гомологи белков для РНК-интерференции (Dicer, RISC-комплекс) присутствуют и у высших животных, киРНК привычными методами не обнаруживались. Каково же было удивление, когда искусственно введённые синтетические аналоги киРНК вызывали сильный специфический дозозависимый эффект в культурах клеток млекопитающих! Это означало, что в клетках позвоночных РНК-интерференция не заместилась более сложными системами иммунитета, а эволюционировала вместе с организмами, превратившись во что-то более «продвинутое». Следовательно, у млекопитающих надо было искать не точные аналоги киРНК, а их эволюционных преемников.

Игрок № 2 - микроРНК

Действительно, на основе эволюционно достаточно древнего механизма РНК-интерференции у более развитых организмов появились две специализированные системы управления работой генов, использующие каждая свою группу малых РНК - микроРНК (microRNA) и пиРНК (piRNA , Piwi-interacting RNA). Обе системы появились ещё у губок и кишечнополостных и эволюционировали вместе с ними, вытеснив киРНК и механизм «голой» РНК-интерференции. Их роль в обеспечении иммунитета снижается, поскольку эту функцию взяли на себя более совершенные механизмы клеточного иммунитета, - в частности, интерфероновая система . Однако эта система настолько чувствительна, что срабатывает и на саму киРНК: появлении в клетке млекопитающих малых двуцепочечных РНК запускает «сигнал тревоги» (активирует секрецию интерферона и вызывает экспрессию интерферон-зависимых генов, что блокирует все процессы трансляции целиком). В этой связи механизм РНК-интерференции у высших животных опосредован в основном микроРНК и пиРНК - одноцепочечными молекулами со специфической структурой, которая не обнаруживаются интерфероновой системой.

По мере усложнения генома микроРНК и пиРНК принимали всё большее участие в регуляции транскрипции и трансляции. Со временем, они превратились в дополнительную, точную и тонкую систему регуляции генома. В отличие от киРНК, микроРНК и пиРНК (открыты в 2001 году, см. врезку 3) не производятся из чужеродных двуцепочечных молекул РНК, а изначально закодированы в геноме организма-хозяина .

Встречайте: микроРНК

Предшественник микроРНК транскрибируется с обеих цепей геномной ДНК РНК-полимеразой II , в результате чего появляется промежуточная форма - при-микроРНК, - несущая признаки обычной мРНК - m 7 G-кэп и полиА-хвост. В этом предшественнике образуется петля с двумя одноцепочечными «хвостами» и несколькими неспаренными нуклеотидами в центре (рис. 3). Такая петля подвергается двухстадийному процессингу (рис. 4): вначале эндонуклеаза Drosha отрезает от шпильки одноцепочечные «хвосты» РНК, после чего вырезанная шпилька (пре-микроРНК) экспортируется в цитоплазму, где узнается Dicer’ом, вносящим ещё два разреза (вырезается двуцепочечный участок, обозначенный цветом на рис. 3). В таком виде зрелая микроРНК, аналогично киРНК, включается в состав комплекса RISC.

Рисунок 3. Структура двуцепочечной молекулы-предшественника микроРНК. Основные особенности: наличие консервативных последовательностей, которые формируют шпильку; наличие комплементарной копии (микроРНК*) с двумя «лишними» нуклеотидами на 3′-конце; специфическая последовательность (2–8 п. н.), формирующая сайт узнавания для эндонуклеаз. Сама микроРНК выделена красным цветом - именно её и вырезает Dicer.

Механизм действия многих микроРНК аналогичен действию киРНК: короткая (21–25 нуклеотидов) одноцепочечная РНК в составе белкового комплекса RISC с высокой специфичностью связывается с комплементарным участком в 3′-нетранслируемой области мРНК-мишени. Связывание приводит к расщеплению мРНК белком Ago. Однако активность микроРНК (по сравнению с киРНК) уже более дифференцирована - если комплементарность не абсолютная, целевая мРНК может не деградировать, а только обратимо блокироваться (трансляции не будет). Тот же RISC-комплекс может использовать и искусственно введённые киРНК. Это объясняет, почему киРНК, сделанные по аналогии с простейшими, активны и у млекопитающих.

Таким образом, мы можем дополнить иллюстрацию механизма действия РНК-интерференции у высших (билатерально-симметричных) организмов, объединив на одном рисунке схему действия микроРНК и биотехнологически введённых киРНК (рис. 5).

Рисунок 5. Обобщённая схема действия искусственных микроРНК и киРНК (искусственные киРНК вводятся в клетку с помощью специализированных плазмид - targeting siRNA vector ).

Функции микроРНК

Физиологические функции микроРНК крайне разнообразны - фактически, они выступают основными небелковыми регуляторами онтогенеза. микроРНК не отменяют, а дополняют «классическую» схему регуляцию генов (индукторы, супрессоры, компактизация хроматина и т. д.). Кроме того, синтез самих микроРНК сложным образом регулируются (определенные пулы микроРНК могут включаться интерферонами, интерлейкинами, фактором некроза опухолей α (ФНО-α) и многими другими цитокинами). В результате вырисовывается потрясающая по своей сложности и гибкости многоуровневая сеть настройки «оркестра» из тысяч генов, но и этим дело не заканчивается.

микроРНК более «универсальны», чем киРНК: «подопечные» гены не обязательно должны быть на 100% комплементарны - регуляция осуществляется и при частичном взаимодействии. На сегодня одна из самых горячих тем в молекулярной биологии - поиск микроРНК, которые выступают альтернативными регуляторами известных физиологических процессов. Например, уже описаны микроРНК, участвующие в регуляции клеточного цикла и апоптоза у растений, дрозофилы и нематоды; у человека микроРНК регулируют иммунную систему и развитие гематопоэтических стволовых клеток . Применение технологий на основе биочипов (micro-array screening) показало, что на различных этапах жизни клеток включаются и выключаются целые пулы малых РНК. Для биологических процессов идентифицировали десятки специфичных микроРНК, уровень экспрессии которых в определённых условиях изменяется в тысячи раз, подчёркивая исключительную управляемость этих процессов.

До недавнего времени считалось, что микроРНК только подавляют - полностью или частично - работу генов. Однако недавно оказалось: действие микроРНК может кардинально отличаться в зависимости от состояния клетки! В активно делящейся клетке микроРНК, связавшись с комплементарной последовательностью в 3′-участке мРНК, ингибирует синтез белка (трансляцию). Однако в состоянии покоя или стресса (например, при росте на бедной среде) то же самое событие приводит к прямо противоположному эффекту - усилению синтеза целевого белка !

Эволюция микроРНК

Количество разновидностей микроРНК у высших организмов ещё до конца не установлено - по некоторым данным, оно превосходит 1% от числа белок-кодирующих генов (у человека, например, говорят о 700 микроРНК, и это число постоянно растет). микроРНК регулируют активность около 30% всех генов (мишени для многих из них пока не известны), причём существуют как повсеместно распространённые, так и тканеспецифичные молекулы - например, один такой важный пул микроРНК регулирует созревание стволовых клеток крови.

Широкий профиль экспрессии в разных тканях разных организмов и биологическая распространённость микроРНК говорит об эволюционно древнем происхождении. Впервые микроРНК обнаружили у нематод, и долгое время потом считали, что эти молекулы появляются лишь у губок и кишечнополостных; однако позже их открыли и в одноклеточных водорослях . Интересно, что по мере усложнения организмов увеличивается также количество и гетерогенность пула микроРНК. Это косвенно свидетельствует о том, что сложность этих организмов обеспечивается, в частности, функционированием микроРНК . Возможная эволюция микроРНК показана на рисунке 6.

Рисунок 6. Многообразие микроРНК у разных организмов. Чем выше организация организма, тем больше у него обнаруживается микроРНК (число в скобках). Красным выделены виды, у которых обнаружены единичные микроРНК.

Между киРНК и микроРНК можно провести чёткую эволюционную связь, опираясь на следующие факты:

• действие обоих видов взаимозаменяемо и опосредуется гомологичными белками;
• киРНК, введённые в клетки млекопитающих, специфично «выключают» нужные гены (несмотря на некоторую активацию интерфероновой защиты);
• микроРНК обнаруживаются у всё более и более древних организмов.

Эти и другие данные позволяют предположить происхождение обеих систем от общего «предка». Интересно также отметить, что «РНКовый» иммунитет как независимый предшественник белковых антител подтверждает теорию зарождения первых форм жизни на основе РНК, а не белков (напомним, что это любимая теория академика А. С. Спирина ).

Чем дальше, тем запутанней. Игрок № 3 - пиРНК

Пока на арене молекулярной биологии было только два «игрока» - киРНК и микроРНК - основное «предназначение» РНК-интерференции казалось совершенно понятным. Действительно: набор гомологичных коротких РНК и белков у разных организмов осуществляет аналогичные действия; по мере усложнения организмов усложняется и функциональность.

Однако в процессе эволюции природа создала ещё одну, эволюционно самую позднюю и узкоспециализированную систему на основе всё того же удачного принципа РНК-интерференции. Речь идет пиРНК (piRNA , от Piwi-interaction RNA ).

Чем сложнее организован геном, тем более развит и приспособлен организм (или наоборот? ;-). Однако увеличение сложности генома имеет и оборотную сторону: сложная генетическая система становится нестабильной . Это ведет к необходимости механизмов, отвечающих за поддержание целостности генома - иначе самопроизвольное «перемешивание» ДНК просто выведет её из строя. Мобильные генетические элементы (МГЭ ) - один из основных факторов нестабильности генома - представляют собой короткие нестабильные участки, которые могут автономно транскрибироваться и мигрировать по геному. Активация таких мобильных элементов приводит к множественным разрывам ДНК в хромосомах, чреватых летальными последствиями.

Количество МГЭ нелинейно увеличивается с размером генома, и их активность необходимо сдерживать. Для этого животные, уже начиная с кишечнополостных, используют всё тот же феномен РНК-интерференции. Эту функцию также выполняют короткие РНК, однако не те, о которых речь уже шла, а третий их тип - пиРНК.

«Портрет» пиРНК

Функции пиРНК

Главная функция пиРНК - подавление активности МГЭ на уровне транскрипции и трансляции. Считается, что пиРНК активны только во время эмбриогенеза, когда непредсказуемые перетасовки генома особенно опасны и могут привести к гибели зародыша. Это логично - когда иммунная система ещё не заработала, клетки эмбриона нуждаются в какой-нибудь простой, но действенной защите. От внешних патогенов эмбрион надежно защищен плацентой (или оболочкой яйца). Но кроме этого необходима оборона и от эндогенных (внутренних) вирусов, - в первую очередь МГЭ.

Эта роль пиРНК подтверждена опытом - «нокаут» или мутации генов Ago3, Piwi или Aub приводят к серьёзным нарушениям развития (и резкому увеличению числа мутаций в геноме такого организма), а также вызывают бесплодие за счёт нарушения развития половых клеток.

Распространение и эволюция пиРНК

Первые пиРНК обнаруживаются уже у актиний и губок. Растения, видимо, пошли другим путём - белки Piwi у них не обнаружены, а роль «намордника» для транспозонов выполняют эндонуклеаза Ago4 и киРНК.

У высших животных - в том числе и человека - система пиРНК развита очень хорошо, но встретить её можно только в эмбриональных клетках и в околоплодном эндотелии. Почему распространение пиРНК в организме столь ограничено - ещё предстоит узнать. Можно предположить, что, как и любое мощное оружие, пиРНК приносит пользу только в очень специфических условиях (во время развития плода), а во взрослом организме их активность нанесёт больше вреда, чем пользы. Все-таки, число пиРНК на порядок превосходит количество известных белков - и неспецифические эффекты пиРНК в зрелых клетках сложно предсказать.

Заключение

В заключение хочется привести таблицу, иллюстрирующую эволюцию белкового аппарата, участвующего в РНК-интерференции (рис. 9). Видно, что у простейших наиболее развита система киРНК (белковые семейства Ago, Dicer), а с усложнением организмов акцент переносится на более специализированные системы - увеличивается число изоформ белков для микроРНК (Drosha, Pasha) и пиРНК (Piwi, Hen1). При этом разнообразие ферментов, опосредующих действие киРНК, уменьшается.

Рисунок 9. Многообразие белков, участвующих в РНК-интерференции (цифры обозначают количество белков каждой группы). Синим цветом подсвечены элементы, характерные для киРНК и микроРНК, а красным - белки , связанные с пиРНК.

Явление РНК-интерференции начали использовать уже простейшие организмы. На основе этого механизма природа создала прототип иммунной системы, а по мере усложнения организмов РНК-интерференция становится незаменимым регулятором активности генома. Два разных механизма плюс три вида коротких РНК (см. таб. 1) - в результате мы видим тысячи тонких регуляторов различных метаболических и генетических путей. Эта поразительная картина иллюстрирует универсальность и эволюционную адаптацию молекулярных биологических систем. Короткие РНК снова доказывают, что «мелочей» внутри клетки нет - есть только мелкие молекулы, всю значимость роли которых мы только начинаем понимать.

(Правда, такая фантастическая сложность говорит скорее о том, что эволюция «слепа» и действует без наперёд утверждённого «генерального плана» »;