«Получение аммиака» - Обеспечить оптимальное протекание химических реакций. Создании альтернативного способа производства аммиака. Создать производство, основанное на современных принципах. При увеличении температуры равновесие смещается в сторону эндотермической реакции. Химизм. Аппарат для получения аммиака. Принципиальная схема производства.
«Метод проектов» - Давать определение понятиям. Видеть проблемы. Осуществление деятельности. На долю учителя остается трудная задача выбора проблем для проектов. Метод учебных проектов. Оформление проектной папки. Классифицировать. «От идеи до реализации». Задавать вопросы. Распределяют роли в группе. Скажи мне - и я забуду.
«Методы психологии» - Выполните задание. Почему знание социальной психологии способствуют более эффективному взаимодействию людей? Место психологии в системе наук. Зачем нужно изучать психологию? Задачи психологии. Тест «Какой вы психолог?». Психология - наука, изучающая факты, закономерности и механизмы психики. Методы изучения человека.
«Основание греческих колоний» - Как изменились права демоса? А существует ли сегодня в нашем государстве демократия? Почему Солон был вынужден покинуть свое государство на длительный срок? Сделай вывод. Урок на тему: «Основание греческих колоний». Основные причины переселений: Основание греческих колоний. Назовите места колонизации на Средиземном море.
«Получение радиоактивных изотопов» - Получение радиоактивных изотопов. Йод интенсивно отлагается в щитовидной железе, особенно при базедовой болезни. Радиоактивные изотопы широко применяются в науке, медицине и технике. Меченые атомы. С помощью ядерных реакций можно получить изотопы всех химических элементов. Для постановки диагноза, так и для терапевтических целей.
«Метод проектов в литературе» - Метод проектов на уроках литературы. Целеустремленность. Все члены команды равны. Презентация. Такой урок включает в себя приемы и методы различных форм обучения. Каждый должен получать удовольствие от чувства уверенности в себе. Цель нетрадиционных уроков: Все должны проявлять активность и вносить свой вклад в общее дело.
А-Выделение чистой культуры из отдельной колонии
Это основной метод выделения чистых культур мо, предложенный Р. Кохом. Принцип- получение чистой культуры из отдельной колонии. Однако этот метод неприменим для выделения мо, которые не растут или плохо растут на плотных средах(некоторые бактерии, многие водоросли и простейшие).
При выделении чистой культуры аэробов накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды. Порядок работы следующий . Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную питательную среду, содержащую агар или желатину, разливают в стерильные чашки Петри. Когда среда застынет, на ее поверхность из пипетки наносят каплю накопительной культуры или ее разведения в стерильной воде и стерильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют каплю сначала по одной половине поверхности среды в чашке Петри,затем по второй половине, после чего этим же шпателем протирают поверхность плотной среды последовательно во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост мо,а в последующих - изолированные колонии. Рассевать накопительную к-ру можно петлей методом истощающего штриха . В этом случае накопительную к-ру или ее разведение отбирают петлей и на поверхности.плотной среды проводят штрихи в таком порядке, как указано на рис. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют в пламени горелки.
После посева чашки помещают в термостат крышками вниз,чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри при застывании агара, не помешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1-7 суток в зависимости от скорости роста мо. Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность скошенной плотной среды в пробирки или в жидкую среду.
Изолированные колонии аэротолерантных мо и факультативных анаэробов чаще получают методом глубинного досева . Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15-20 мл и стерилизуют. Непосредственно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную баню, чтобы среда расплавилась. Высев проводят из разведений накоп-ой к-ры в стерильной водопроводной воде. Разведения готовят с таким расчетом, чтобы при высеве 0,5-1,0 мл разведения получить изолированные колонии. Степень разведения определяется плотностью накоп-ой к-ры. Высевы делают, как правило, из 3-4х последних разведений. Для этого в пробирку с расплавленной и остуженной до 48-50°агаризованной средой вносят 0,5-1,0 мл одного из разведений накопительной культуры. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки вынимают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени горелки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашку Петри. После того как агаризованная среда застынет, чашки Петри помещают в термостат. Колонии, выросшие в толще среды, вырезают стерильным скальпелем или извлекают стерильными капиллярными трубками или просто петлей и переносят в жидкую среду.
Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов . Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев проводят на поверхность среды в чашки Петри, но после посева чашки тотчас помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения -разведения накоп-ой к-ры проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50° агаризованной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений. Затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (3:1), что препятствует проникновению воздуха в толщу агаризованной среды.
Иногда агаризаванную питательную среду после посева и тщательного перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри . Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение накопительной культуры в расплавленной агаризованной питательной среде. Конец капилляра запаивают. При удачно выбранном разведении накопительной культуры в одной из пробирок (пипеток Пастера, трубок Бурри) вырастают изолированные колонии. Извлечение образовавшихся колоний - а)удаляют стерильной иглой слой парафина и вазелинового масла, а столбик агаризованной среды выдувают из пробирки в стерильную чашку Петри, пропуская газ, не содержащий кислорода, через капилляр, который помещают между стенкой пробирки и агаризованной средой. Агаризованную среду из трубки Буррл выдувают, пропуская газ через ватную пробку.
б)робирку слегка нагревают, все время быстро вращая ее над пламенем горелки. При этом агар, непосредственно прилегающий к стенке, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным ланцетом и извлекают колонии, захватывая их стерильными капиллярными трубками или петлей. Можно также вырезать их стерильным ланцетом. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции поверхности его разламывают стерильным пинцетом и участки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.
Для получения изолированных колоний методом глубинного посева и методом разведений рекомендуется использовать осветленные питательные среды.
Получение изолированных колоний анаэробов ,- используют метод вращающихся пробирок Хангейта . (сущность)- расплавленную агаризованную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку. Агаризованная среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя агаризованной среды в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.
Выделение чистой культуры
Основным методом выделения чистых культур бактерий является метод, предложенный Р. Кохом, принцип которого заключается в получении культуры бактерий из изолированных колоний. При выделении чистой культуры аэробов накопительную культуру или исследуемый материал высевают на плотную питательную среду. Порядок работы следующий. Расплавленную питательную среду разливают в стерильные чашки Петри. После того как среда застынет, на её поверхность наносят каплю исследуемого материала и стерильным шпателем Дригальского распределяют каплю сначала по одной стороне поверхности питательной среды в чашке Петри, затем по второй. Этим же шпателем протирают поверхность плотной среды во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Чашки инкубируют при оптимальной для микробов температуре (чаще всего - 37°С) до 2-х суток. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микробов, тогда как в последующих - изолированные колонии.
Рассеивать накопительную культуру можно методом истончающегося штриха. В этом случае накопительную культуру или её разведение отбирают петлей и проводят штрихи по плотной питательной среде в чашке Петри в определенном порядке. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют. Чашки термостатируют 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизма. Выросшие изолированные колонии методом штриха отсевают петлей в пробирки на поверхность скошенной среды или в жидкую среду.
Изолированные колонии анаэробов и факультативных анаэробов получают методом глубинного посева. С этой целью в пробирки с расплавленной питательной средой, охлажденной до 40-37°С, высевают по 0,5-1,0 мл разведения исследуемого материала с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Среду быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла. Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение агаризованной среды с посевом. Конец капилляра запаивают. При удачно выбранном разведении в пробирке или пипетке вырастают изолированные колонии. Для их извлечения пробирку (или пипетку) слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки или быстро опустив в теплую воду, при этом агар, прилегающий к стенке, плавится и содержимое столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным скальпелем и извлекают колонии, захватывая их стерильной капиллярной пипеткой или петлей. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции его разламывают стерильным пинцетом и участки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.
Определение чистоты выделенной культуры
Чистота колоний, отсеянных на косой агар, может быть проверена несколькими способами: визуальным, контролем под микроскопом и высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной питательной среды. Если рост по штриху неоднороден, то культура считается загрязненной. Однако, такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных питательных сред. Поэтому чистоту культуры обязательно нужно контролировать под микроскопом. Для этого готовят препарат окрашенных клеток и просматривают его с иммерсией. Чистая культура должна быть морфологически однородна и может иметь лишь незначительное варьирование размеров клеток.
Определение систематического положения бактерий включает изучение совокупности признаков: морфологических, культуральных и физиолого-биохимических.
Культуральные признаки
К культуральным или макроморфологическим признакам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.
Рост на плотных питательных средах .
На поверхности плотных питательных сред микробы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона. Колонией называется изолированное скопление клеток одного вида, выросшее в большинстве случаев из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки, различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием. При их описании учитывают следующие признаки:
форму колоний - округлая, амёбовидная, неправильная, ризоидная и т.д.;
поверхность колонии - гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, радиально исчерченная, с концентрическими кругами;
профиль колонии - плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный, выпуклый в центре с валиком по краю, вдавленный в центре, с валиком по краю и др.;
блеск и прозрачность - блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;
цвет колонии - бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная - белая, жёлтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, чёрная. Особо отмечают выделение пигмента в субстрат;
край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый, корневидный и др.;
структуру колонии - однородная, мелко- и крупнозернистая, струйчатая (край и структуру колонии определяют с помощью лупы или при малом увеличении микроскопа);
консистенцию колонии - её определяют, прикасаясь к колонии петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей, пленчатой (снимается целиком), хрупкой.
Глубинные колонии довольно однообразны. Чаще всего они похожи на сплющенные чечевички, в проекции имеющие форму овалов с заостренными концами. Колонии немногих бактерий напоминают пучки ваты с нитевидными выростами в среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микробы образуют газы. Донные колонии самых разнообразных микроорганизмов имеют вид тонких прозрачных пленок, стелящихся по дну.
Размеры и некоторые другие признаки колоний меняются с возрастом и зависят от состава среды, поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды, температуру культивирования.
При описании роста микроорганизма по штриху отмечают следующие особенности: рост скудный, умеренный или обильный, сплошной с ровным или волнистым краем, четко видный, напоминающий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоидный. Характеризуют оптические свойства налета, его цвет, поверхность и консистенцию.
Рост на жидких питательных средах .
Различают следующие формы роста бактерий на жидких питательных средах:
Помутнение среды . Такой рост характерен для многих патогенных микробов, относящихся к группе факультативных анаэробов.
Придонный рост . Характеризуется образованием осадка на дне пробирки. Он может быть скудным или обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев. Консистенция осадка бывает вязкая, слизистая, хрупкая или пастообразная. Если культура не образует пигмента, то цвет среды не изменяется и осадок приобретает серовато-белый или желтоватый цвет. Придонный рост характерен для бактерий с анаэробным типом дыхания.
Пристеночный рост бактерий выражается в том, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остаётся прозрачной. Бактерии растут в виде крупных рыхлых хлопьев или компактных зёрен, прикреплённых к внутренней поверхности стенок пробирки.
Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности жидкой питательной среды плёнки. Плёнка может быть тонкой, бесцветной, исчезающей при встряхивании или взбалтывании, влажной, вязкой, слизистой, плотной, сухой, при взятии с неё материала сниматься целиком в виде круглого диска. Нередко рост микроорганизмов в жидкой питательной среде сопровождается появлением газа и запаха.
Метод Пастера (метод предельных разведений). Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма. Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.
Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотных питательных сред. К таким методам относятся метод Коха и метод Дригальского.
Метод Коха (метод глубинного посева). Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленной плотной питательной средой. Равномерно размешивают содержимое пробирки, вращая ее между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй – в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды в чашках, их помещают в термостат для культивирования.
Для выделения анаэробных микроорганизмов по методу Коха необходимо ограничить доступ кислорода к культуре. С этой целью поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и вазелина (1:1). Можно также оставлять посевной материал, тщательно перемешанный с агаризованной средой, непосредственно в пробирке. Ватную пробку при этом заменяют резиновой или заливают поверхность агара смесью парафина и вазелинового масла. Чтобы извлечь выросшие колонии анаэробных микроорганизмов, пробирки слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей или стерильной капиллярной рубкой и переносят в жидкую среду.
Метод Дригальского основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри. Каждая микробная клетка, фиксируясь в определенном месте, начинает размножаться, образуя колонию.
Для посева по методу Дригальского используют несколько чашек Петри, залитых плотной питательной средой. На поверхность среды вносят каплю исследуемого материала. Затем с помощью стерильного шпателя эту каплю распределяют по всей питательной среде (посев газоном).
Посев также можно проводить штрихом, используя бактериологическую петлю. Этим же шпателем или петлей осуществляют посев во вторую, третью и т.д. чашки. Как правило, в первой чашке после культивирования посева появляется рост микробов в виде сплошного налета, в последующих чашках содержание микроорганизмов снижается и образуются изолированные колонии, из которых отсевом можно легко выделить чистую культуру.
Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки.
В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом (метод истощающего штриха). Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие сектора. При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток.
Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам. Например, с помощью этого метода можно выделить чистую культуру туберкулезных микобактерий, устойчивых к действию кислот, щелочей и спирта. В этом случае исследуемый материал перед посевом заливают 15 % раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате в течение 3…4 часов. После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи обработанный материал высевают на плотную среду и получают изолированные колонии возбудителя туберкулеза.
Важным этапом бактериологического исследования ляется посев. В зависимости от цели исследования, харак ра посевного материала и среды используют разные методь посева. Все они включают обязательную цель: оградить пс сев от посторонних микробов. Поэтому работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебан* воздуха. Во время посевов нельзя разговаривать. ПосевМ лучше делать в боксе (при работе с заразным материалол необходимо выполнять правила личной безопасности).
Этапы выделения чистой культуры:
1-й день - получение изолированных колоний. Кашп исследуемого материала петлей, пипеткой или стеклянной палочкой наносят на поверхность агара в чашке Петри. Шпа-i телем втирают материал в поверхность среды; не прожиг и не перевертывая шпателя, производят посев на 2-й, а тем на 3-й чашке. При таком посеве на 1-ю чашку приходится много материала и соответственно много микробов, на 2-ю меньше и на 3-ю еще меньше.
Можно получить изолированные колонии при посеве петлей. Для этого исследуемый материал эмульгируют в бульоне или изотоническом растворе натрия хлорида.
2-й день - изучают рост микробов на чашках. В 1-й чашке обычно бывает сплошной рост - выделить изолированную колонию не удастся. На поверхности агара во 2-й и 3-й чашке вырастают изолированные колонии. Их изучают невооруженным глазом, с помощью лупы, при малом увеличении микроскопа и иногда в стереоскопическом микроскопе. Нужную колонию отмечают со стороны дна чашки и пересевают на скошенный агар. Посевы ставят в термостат. (Пересевать можно только изолированные колонии.)
3-й день - изучают характер роста на скошенном агаре. Делают мазок, окрашивают его и, убедившись в том, что культура чистая, приступают к ее изучению. На этом выделение чистой культуры заканчивается. Выделенная из определенного источника и изученная культура называется «штаммом».
При выделении чистой культуры из крови (гемокуль-туры) ее предварительно «подращивают» в жидкой среде: 10-15 мл стерильно взятой крови засевают в 100-150 мл жидкой среды. Так поступают потому, что в крови обычно мало микробов. Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1: 10 не случайно - так достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно действует на микроорганизмы). Колбы с посевом ставят в термостат. Через сутки (иногда через большее время, в зависимости от выделяемой культуры) из содержимого колб делают высевы на чашки для получения изолированных колоний. При необходимости повторяют высевы с интервалом в 2-3 дня.
При выделении чистой культуры из мочи, промывных вод желудка и других жидкостей их предварительно центрифугируют в асептических условиях и засевают осадок. Дальнейшее выделение чистой культуры производят обычным способом.
Для выделения чистой культуры широко применяют элективные среды. В ряде методов для получения чистых культур используют биологические особенности выделяемог микроба. Например, при выделении спорообразующих бак- терий посевы 10 мин прогревают при 80°С, убивая этим ве- гетативные формы. При выделении возбудителя туберкуле-j за, устойчивого к кислотам и щелочам, с помощью этих ве-1 ществ посевной материал освобождают от сопутствующей! флоры. Для выделения пневмококка и палочки чумы иссле-1 дуемый материал вводят белым мышам - в их организме высокочувствительном к данным возбудителям, эти микро-] бы размножаются быстрее других.
В научно-исследовательской работе, особенно при гене-; тических исследованиях, необходимо получать культуры за-1 ведомо из одной клетки. Такая культура называется «клон»] Для ее получения чаще всего пользуются микроманипуля-^ тором - прибором, снабженным инструментами (иглами] пипетками) микроскопических размеров. С помощью дер-j жателя под контролем микроскопа их вводят в препарат «B сячая капля», извлекают нужную клетку (одну) и переносят ее в питательную среду.
Изучение выделенных культур
Изучение морфологии, подвижности, тинкториальныл свойств, характера роста на средах (культуральные свойства);! ферментативной активности и ряда других особенностей вы! деленного микроба позволяет установить его таксономичес| кое положение, т. е. классифицировать микроорганизм: оп| ределить его род, вид, тип, подтип, разновидность. Это на зывается «идентификацией». Идентификация микроорганиз| мов очень важна при диагностике инфекций, установлена источников и путей ее передачи и в ряде других научно-л тических исследований.